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双向电泳斑点检测

     双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化. 双向电泳原理简明,苐一项进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离。
     分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外,还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前,没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法,可检测少到2~5ng的蛋白,因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色,一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性,并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳),即应用两种不同的染料荧光标记两个样品,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个,避免了几种2-DE的比较,可在纳克级进行检测.
     较早期相比,2-DE有两个主要的进步:首先,极高的重复性使有机体的参考图谱,可通过Internet获得,来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次,高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术. 
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