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双向电泳的第一向等电聚焦

 
⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含IPG buffer)一小管(1ml/管),置室温溶解。

⒉ 在小管中加入0.01g DTT, 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer,充分混匀。

⒊ 从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品(考马斯亮蓝染色需样品1mg,银染需300μg),充分混匀。

⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条,室温中放置10分钟。

⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。双向电泳在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⒎ 分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⒐ 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。

⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。



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