生物技术实验研究报告-CRISPR基因编辑

通过活体胚胎电穿孔进行CRISPR介导小脑颗粒细胞功能丧失研究

脑畸形是指在怀孕期间大脑没有完全形成，并与一些神经和发育问题有关。这种畸形通常是由基因突变引起的，破译参与正常大脑发育的关键基因有助于识别导致大脑**和肿瘤形成的潜在因素。为了帮助识别小脑的体细胞突变，研究人员利用基因工程小鼠模型，结合电穿孔的基因传递和CRISPR/Cas9技术，开发了一种新的方法来研究一些基因在小脑发育过程中的作用。简单地说，通过**活体电穿孔，将携带向导RNA(sgRNA)和Cre的单个质粒导入Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP(条件性敲入)小鼠的小脑干细胞/前体细胞中。这种方法能够成功地标记颗粒神经元前体细胞，并允许跟踪其子代(子细胞)在产后大脑发育过程。

                              外颗粒细胞层中表达gfp的细胞可以观察到以ki67标记的增殖，将表达对照sgRNA的

                               质粒pU6-sgRNA-Cbh-Cre 通过活体电穿孔导入到E13.5的Rosa26-CAG-LSLCas9-P2A-EGFP

                              小鼠胚胎中，对P7小脑进行GFP,Ki67和p27的**染色。DAPI(蓝色)对切片进行复染。

ECM 830 & GEMINI 活体胚胎电穿孔Protocol

细胞: CRISPR – sgRNA 质粒导入小脑颗粒细胞，

应用: E13. 5小鼠活体胚胎电穿孔

电极：5 mm 直径铂金镊子电极 # 45-0489

准备向导RNA (sgRNA) 和cre重组酶质粒，终浓度至少1ug/ul，准备fast green染料（终浓度0.05%）。将fast green染料溶于蒸馏水制成1%浓度染料，通过0.22μm滤膜去除染料颗粒。准备一个拉针仪(内径:0.6 - -0.8毫米)制作玻璃毛细管微量吸液管，每个小鼠（~12胚胎）注射~15ul质粒染料混合液，并立即进行手术。异氟烷麻醉孕13天的孕鼠，暴露**，穿透背部后脑将大约1μl fast green混合的质粒注射到第四脑室中，使用铂金镊子施加方波脉冲。

方波电穿孔设置:

电压: 32 V

脉冲时间: 50 ms

脉冲个数: 5

脉冲间隔时间: 950 ms

电穿孔步骤:

样本体积 : ~15 ul质粒和fast green混合液/小鼠 (~ 12 胚胎)

电极: 将电极横向放置，负极覆盖耳朵，正极置于**壁上方小脑原基

电脉冲 : 点击Go 或 Start 按键，启动自动充电和脉冲序列

电击后处理 : 刺激结束后迅速将**移回母鼠腹腔，缝合 腹膜和皮肤，进行麻醉复苏，细心饲养。

参考文献:

Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H. K.,Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).