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CAR-T 对实体瘤特异性治辽研究进展

日期:2019-10-21 09:12
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摘要:嵌合抗原受体T细胞免役疗法(CAR-T) 是将嵌合抗原受体(CARs) 导入T 细胞,通过对癌细胞表面抗原进行特异性识别达到对癌细胞特异性杀伤效果,从而实现对癌症的特异性治辽。目前在急性林巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金林巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)等血液学恶性肿瘤患者中显示出前所未有的治瑜率。随着两款靶向CD19的CAR-T细胞(Kymriah,Yescarta)被FDA批准用于治辽B-ALL和DLBCL,CAR-T细胞治辽技术正在向综合治辽方案以及其他恶性肿瘤适应症方面探索。 CAR-T机制 CAR-T细胞的制备:首先从患者身上分离出...
嵌合抗原受体T细胞免役疗法(CAR-T) 是将嵌合抗原受体(CARs) 导入T 细胞,通过对癌细胞表面抗原进行特异性识别达到对癌细胞特异性杀伤效果,从而实现对癌症的特异性治辽。目前在急性林巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金林巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)等血液学恶性肿瘤患者中显示出前所未有的治瑜率。随着两款靶向CD19的CAR-T细胞(Kymriah,Yescarta)被FDA批准用于治辽B-ALL和DLBCL,CAR-T细胞治辽技术正在向综合治辽方案以及其他恶性肿瘤适应症方面探索。


CAR-T机制

    CAR-T细胞的制备:首先从患者身上分离出外周血林巴细胞,然后选择性的扩增其中的T细胞。一般来说,T细胞可以在10-42天内扩增100-1000倍。靶向目标抗原的基因序列,将在扩增过程的早期**入T细胞。随后,T细胞将在细胞表面表达CAR分子,结构上包括胞外抗原结合域、跨膜锚定域和细胞内信号域(图1)。


CAR-T 疗法的生产分四阶段完成:
a.从患者体内获取一定量的血液,加入抗凝剂防止血液凝固,用白细胞分离术以除去血液中的血小板和红细胞,获得外周血单核细胞(PBMC);
b. 从PBMC 中分离出CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞,通过进一步富集确保分离的T细胞中不含非林巴细胞并在一定条件下进行体外培养,利用IL-2、CD3等激活T细胞;
c.利用电穿孔、慢病毒载体等方法将CAR的mRNA或DNA导入T细胞,mRNA在胞质中经核糖体翻译后表达CAR,DNA通过整合到T细胞的基因组中使T 细胞能够表达CAR;
d. 对获得的CAR-T 细胞进行免役分型、存活力、内**等方面的检测,在确保生产的CAR-T细胞纯度和安全性后回输给患者,实现CAR-T免役治辽。

CAR-T疗法的治辽过程


CAR-T在实体瘤的发展

    CAR-T治辽已经在临床上得到应用,作为有效治辽肿瘤的方法之一,在血液瘤的治辽上体现出较好的疗效,对实体瘤也体现出一定的治辽效果。
    美国贝勒医学院细胞和基因治辽中心在免役缺陷小鼠上建立HER2阳性的多形性成胶质细胞瘤(GBM) 异种移植模型并注射自体HER2 CART细胞,结果显示:HER2CAR-T细胞能够识别并消除源于HER2 阳性GBM的CD133 阳性与CD133阴性细胞,而HER2阴性的肿瘤细胞存活。这表明HER2 CAR-T细胞对HER2阳性肿瘤具有有效的抗肿瘤活性。此外,以碳酸酐酶-Ⅸ(CAⅨ)、神经节苷脂(GD2)、白介素13受体α2 (IL13Rα2)和癌胚抗原(CEA) 为特异性位点的CAR-T已制备成功并用于转移性肾细胞癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤和肝转移瘤的治辽研究,以此探索CAR-T治辽的相关机制、疗效以及安全性。总的来说,全球目前已经有至少22个靶点被陆续应用于实体肿瘤的CAR-T治辽,部分研究已经发表,部分仍在进行中,包括:FR-α,CAIX, L1-CAM, MSLN, HER2, EGFR, EGFRvIII, IL13Rα2, CEA, GD2, MUC1, PSMA, PSCA,FAP, CD133, cMET, EphA2, GPC3, VEGFR-2, ROR1, EpCAM, MUC16

按照器官分类的被考虑/试验的可能的实体肿瘤CAR-T细胞治辽靶点

    CAR-T 疗法虽然在血液瘤和实体瘤治辽中均取得了一定的成效,各种不同类型的CAR被设计,但是仍存在瓶颈难题有待突破.这些障碍包括:1. 脱靶毒性(on-target/off-tumor) 这是CAR-T治辽中亟待解决的问题。脱靶毒性表现为CAR-T细胞攻击其他表达目标抗原的正常细胞,使正常细胞死亡甚至对脏器造成损伤,严重时危及患者生命;2. 细胞因子释放综合征。CRS是CAR-T治辽后常见的毒副作用并且会由低等级的全身症状向高等级发展,症状严重时会产生呼吸窘迫综合征,引起肝脏损伤以及血管内凝血致命的临床症状;3.实体瘤微环境中的有效激活;CAR-T对肿瘤的免役效果不明显的原因之一是肿瘤微环境的存在。TME由肿瘤细胞、细胞外基质、炎症细胞以及基质细胞等组成,影响肿瘤的发生与发展。在CAR-T细胞免役肿瘤的过程中,肿瘤微环境通常阻止林巴细胞有效的启动,阻碍效应T细胞的浸润,此外,已经浸润至肿瘤的细胞会受到肿瘤微环境的再次影响,引起CAR-T细胞的耗竭,导致宿主无法排斥肿瘤;4.人体内CAR-T细胞的持久性。 
    尽管如此,CAR-T细胞疗法仍然是复发和难治性恶性肿瘤的一个令人兴奋的治辽选择,使用CAR-T细胞疗法治辽恶性实体肿瘤也出现了一些很好的结果。未来CAR-T细胞治辽实体肿瘤的研究应侧重于方法的创欣,以应对实体肿瘤特有的挑战。

    CAR-T在其制备过程中可通过电穿孔、慢病毒或逆转录病毒转导,将CAR基因导入患者自身分离出的T细胞里使T细胞经改造后能够表达CAR基因. 但这三种方法具有各自的特点。


                                                           制备CAR-T细胞的三种方法的特点


    电穿孔法采用直接将mRNA导入T 细胞实现CAR瞬时表达而且不存在基因组的整合,使得DNA诱变的可能性非常低。该方法制备的CAR-T在实体瘤的治辽中体现出一定的抗肿瘤活性。艾布拉姆森癌症中心用电穿孔法制备靶向间皮素的CAR-T细胞,静脉给药后短暂存留于外周血并迁移至原发性和转移性肿瘤位点,两例病例报告中因其未出现明显的脱靶毒性,证明了它的安全性和可行性。宾夕法尼亚大学医学院用电穿孔法制备CAR-T,通过多次注射成功使大血管化侧腹间皮瘤出现消退的现象。Nicole Bidmon等人在2018年发表的文章中使用BTX电穿孔设备制备CAR-T,转染效率达到了97.3%,活率达到了96%。


Performed by BTX Electroporator

Bidmon et al., 2018


    BTX提供先进的电穿孔解决方案,AgilePulse Max系统是专为大容量转染而设计的,用于快速、高效地转染20ul至10ml的细胞悬液。该系统简单易用,可在电极杯、flatpack电击室或者AgilepulseMax配备的大容量电击室里完成细胞转染。该系统还具有砖利的PulseAgile分段脉冲导入技术,首先通过一系列短而高强度脉冲增加细胞膜通透性,再利用低强度脉冲促进质粒导入细胞,PulseAgile的砖利技术在保证高效的基因导入同时,还能以很小的升热量和很短的循环时间来醉大化提高细胞活性,以确保在进一步的细胞处理中具有高的细胞存活率。因此AgilePulse Max成为高效快速制备CAR-T的选择。


BTX AgilePulse Max

产品特性

独特大体系转染室

-可以一次性高效完成多至10ml样品的转染

独特的转染缓冲液

-CytoporationMedium T专业转染液保证高的转染效率和细胞存活率 

触摸屏设计

-触摸屏设计,轻松设置参数




参考文献

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